生物世界_Nature子刊:CRISPR检测新技术,可快速诊断癌症和心脏病

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由 Aspen 发表于2022-08-19 11:45:31

撰文丨Aspen
来源丨金斯瑞

近年来,CRISPR 诊断技术获得了飞速发展。2016年,美洲的寨卡(Zika)病毒爆发为第一个获批的 CRISPR 诊断创造了条件。此后,CRISPR 诊断技术被先后运用于拉沙病毒(Lassa)、埃博拉病毒(Ebola)以及新冠病毒检测。

这些传染性疾病的诊断往往依赖于对生物标志物的检测。例如,如果在受试者体内检测到新冠病毒基因,就表明受试者可能已被新冠病毒感染。

除了传染性疾病的生物标志物外,心脏病和癌症等非传染性疾病也有特定的生物标记物。例如,血液中的前列腺特异性抗原(PSA)有时就可以作为前列腺癌诊断的依据。

然而,不管是传染性疾病还是非传染性疾病诊断,这些测试通常需要控制温度,并涉及多个复杂的步骤。这为生物标志物诊断的普及和应用带来了巨大的障碍

2022年8月4日,伦敦帝国理工学院和博德研究所的研究人员在 Nature 子刊 Nature Nanotechnology 上发表了题为:Nanozyme-catalysed CRISPR assay for preamplification-free detection of non-coding RNAs 的研究论文。

该研究开发了一种易于使用的 CRISPR 检测技术,这项名为 “CrisprZyme” 的新检测技术虽然同样通过检测生物标志物来实现,但该过程可以在室温下进行,且操作简便,能够更快地诊断心脏病和癌症等非传染性疾病


从 CRISPR 诊断开始

CrisprZyme 在 CRISPR 诊断的基础上发展而来。CRISPR 诊断被称为下一代分子诊断技术,主要利用 RNA 来检测血液或尿液等生物液体中的生物标志物,包含样本前处理(含预扩增)、靶标识别、信号释放和检测几部分。

传统 CRISPR 诊断往往需要扩增 RNA 靶标来放大信号。然而,这种扩增必须在温度控制下才能实现,这需要昂贵的设备来支持。此外,尽管检测结果能指示受试者是否患有传染病,但它们不能告诉医务人员病人体内生物标志物的具体含量。这些信息对于监测心脏病和癌症等非传染性疾病来说,恰恰是至关重要的。

与传统的 CRISPR 诊断方法不同,CrisprZyme 利用比色分析来确定生物标志物的数量。在检测过程中,研究人员利用了一种叫做 “纳米酶”的合成材料。这种材料尺寸小,具有与 “生物酶” 类似的活性,可以增加测试的信号,使比色分析更容易阅读。因此 CrisprZyme 诊断过程无需依赖RNA的信号放大,这样就不需要温度控制和其他复杂的诊断步骤。

本研究的第一作者 Marta Broto 博士认为,CrisprZyme 技术可以简化临床诊断测试流程,能够向临床医生提供正确的工具,使其能在同一医疗点内进行诊断,而不必重新安排后续分析和血液测试。

CrisprZyme 的检测能力

为了评估定量检测的目标 RNA 浓度,研究人员测试了不同的 Cas13 检测方法的检测能力。传统的基于荧光的 Cas13 分析法的检出限 (limit of detection, LOD)在皮摩尔级(pM, 10-12 mol)。CrisprZyme 的 LOD 为7.88 ± 3.21 pM,可与其他需要电化学供能读取的无扩增策略相媲美。

重要的是,在室温下进行反应时,CrisprZyme 的 LOD 是相似的,这表明这一技术具有在普通医疗点内应用的潜力。此外,当 CrisprZyme 利用不同的 Cas酶时,可以呈现不同的特性。例如,研究人员用 LbuCas13a 代替 LwaCas13a 时,发现 CrisprZyme 的 LOD 可以进一步精确到飞摩尔级(fM,10-15 mol),这大大提升了检测的灵敏度。

因为非编码 RNA (ncRNA) 中含有一些具有应用前景但又难以检测的生物标志物,因此学者们尝试利用 CrisprZyme 来检测不同的 ncRNA。他们的测试结果显示,CrisprZyme 可以实现对合成标准的 microRNA-223 (miR-223)、极光激酶A (AURKA) circRNA 和长非编码 RNA LIPCAR (lnc-LIPCAR) 在皮摩尔范围内的定量检测。

CrisprZyme 对不同 ncRNA 靶标的检测表现

利用 CrisprZyme 诊断人类疾病

为了表明 CrisprZyme 的应用潜能,研究人员尝试利用这一技术来检测不同的人类ncRNA,包括 miRNA、lnc-LIPCAR 和 circRNA。

由于 miRNA 的细胞型特异性表达可以作为细胞命运转化的指标,因此学者们可以通过感知 miRNA-143-3p(miR-143-3p)来监测诱导多能干细胞(iPSCs)到心肌细胞(CMs)的体外分化。他们的研究表明,在无需扩增的情况下,CrisprZyme 可以成功检测到 miR-143-3p 在诱导的心肌细胞中上调表达

体外诱导多能干细胞向心肌细胞分化的检测结果

随后,学者们检测了59例胸痛急诊患者的血液中 lnc-LIPCAR 的表达情况,展示了 CrisprZyme 在严重心肌损伤诊断中的应用潜力。他们发现,lnc-LIPCAR 在高敏感性肌钙蛋白T (hsTnT) 水平高于6 pg ml-1的患者中表达上调,而对照组的肌钙蛋白T水平低于6 pg ml-1,这表明 CrisprZyme 能够识别广泛的心力衰竭患者

心力衰竭患者血浆的检测结果

此外,circRNA 在人类疾病中会差异表达,可以作为疾病诊断的生物标志物。学者们可以通过测量环状 AURKA RNA(circ-AURKA)的表达量来区分两种前列腺癌类型:神经内分泌前列腺癌(NEPC)和前列腺癌(ACA)。circ-AURKA 在 ACA 中表达较少,在 NEPC 中表达较多。学者们在本研究中发现 CrisprZyme 在样本总量为10的情况下,可从9个 NEPC 活检标本的总 RNA 分离物中检测到 circAURKA,而同样10个 ACA 活检标本中,仅检出1个 circAURKA 阳性。这表明了 CrisprZyme 在前列腺癌诊断中的应用潜力。

前列腺癌患者组织检测结果

论文通讯作者 Molly Stevens 教授表示,CrisprZyme 是一种比现有测试更简单的诊断方法,既可以检测生物标志物的存在,还能提供生物标志物的含量信息。这不仅可以帮助我们诊断疾病,还可以监测随着时间推移的疾病进展和对治疗的反应

论文链接
https://www.nature.com/articles/s41565-022-01179-0

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作者:Aspen

公众号:生物世界

发布时间:2022-08-19 11:45:31

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